Als een arts denkt dat een patiënt mogelijk een mitochondriële ziekte heeft, vraagt hij in eerste instantie een screenend onderzoek aan van bloed, urine en/of hersenvocht. In zo'n 'screenend metabool onderzoek' worden de lichaamsvloeistoffen op een heleboel stofwisselingsproducten onderzocht. Sommige stofwisselingsproducten zijn een aanwijzing dat de patiënt een mitochondriële ziekte heeft. Dat zijn bijvoorbeeld:
- het aminozuur alanine (onderdeel van veel eiwitten): een verhoogde hoeveelheid alanine kan wijzen op een afwijking in de ademhalingsketen;
- lactaat (melkzuur): een langdurig verhoogde hoeveelheid melkzuur in het bloed (lactaatacidemie) kan wijzen op een afwijking in de ademhalingsketen.

Als uit het screenend metabool onderzoek afwijkende waarden komen, is verder onderzoek nodig om de diagnose te bevestigen. Er wordt dan een spierbiopt genomen: een klein stukje spier (meestal uit het bovenbeen) van de patiënt wordt verwijderd voor onderzoek. Onder de microscoop wordt gekeken hoe de spier is opgebouwd en wordt gemeten hoeveel energie er geproduceerd wordt.
Vervolgens worden de enzymen gemeten die betrokken zijn bij de productie van energie. Aanvullend worden de enzymcomplexen soms ook nog in een huidbiopt gemeten. Het is niet altijd mogelijk om met een spier- of huidbiopt het precieze enzymdefect te bepalen dat de ziekte veroorzaakt.

Een laatste stap in de diagnostiek is het proberen op te sporen van de genetische fout. Die informatie kan belangrijk zijn met het oog op erfelijkheidsadvisering, voor het bepalen van de prognose en voor prenatale diagnostiek van een volgende zwangerschap. Op termijn is deze informatie ook van belang voor het ontwikkelen van mogelijke behandeling van de ziekten.