De diagnose kan worden gesteld met laboratoriumonderzoek. Huid- of bloedcellen kunnen ook voor het stellen van de diagnose worden gebruikt. Daarin meten onderzoekers de activiteit van de verschillende carboxylase-enzymen, met en zonder biotine. Ook de activiteit van het enzym holocarboxylasesynthetase zelf kan worden bepaald. Dan kijkt men naar de mate waarin de vitamine biotine wordt omgezet door HCS. Dit evenwicht is bij HCS-patiënten altijd verschoven.

Hielprik
In 2007 is de screening van pasgeborenen (de 'hielprik') uitgebreid. Het bloed van de pasgeborenen wordt nu ook onderzocht op HCS. Dat kan betekenen dat de diagnose al kan worden gesteld voordat een baby ziekteverschijnselen vertoont. De behandeling kan dan zo snel mogelijk worden ingezet, zodat schade door ontregelingen wordt voorkomen.