Om de diagnose te kunnen stellen, moet met laboratoriumonderzoek de activiteit van het enzym pyruvaatcarboxylase worden gemeten.

Hiervoor wordt bloed en een stukje huid afgenomen bij de patiënt.
Het is mogelijk om ook de enzymactiviteit bij de directe familie van de patiënt te bepalen, maar dit geeft niet altijd een eenduidige uitslag. Prenataal onderzoek is uitgevoerd bij enkele gezinnen waarin al eerder een kindje met pyruvaatcarboxylase deficiëntie was geboren.