De diagnose wordt meestal gesteld in twee stappen: een screenend onderzoek en onderzoek dat specifiek gericht is op het Syndroom van Barth. Bij het screenend onderzoek doet de arts eerst lichamelijk onderzoek en maakt een echografie van het hart, een thoraxfoto en een elektrocardiogram. Daarna volgt laboratoriumonderzoek van de bloedcellen en de urine. Bij jongens met het Syndroom van Barth wordt meestal een verhoogde uitscheiding van enkele organische zuren, vooral het 3-methyl-glutaconzuur, in de urine vastgesteld. Dat is dus een duidelijke indicatie van de diagnose.
Met specifiek onderzoek kan de diagnose onomstotelijk worden vastgesteld. Daarbij wordt de functie van de mitochondriën onderzocht. Deze hebben bij patiënten met het Syndroom van Barth een afwijkende functie door een gebrek aan cadiolipine. Cardiolipine bestaat in verschillende vormen, het zogenaamde tetralineoyl-cardiolipine is de actieve vorm. Het is mogelijk bij patiënten met het Syndroom van Barth de fout in de vorming van tetralineoyl- cardiolipine vast te stellen, onder meer in gekweekte huidcellen (fibroblasten). Als laatste kan nog DNA-onderzoek worden gedaan: een mutatieonderzoek van het gen dat verantwoordelijk is voor het Syndroom van Barth.